平成20年度研究成果報告書

プロジェクトID番号　0715

新規抗菌性ペプチドAG-30の創傷治療への応用に関する研究

総括研究代表者　玉井　克人（大阪大学・准教授）

プロジェクト開始から現在までの研究の要旨
我々が同定した新規ペプチドAG(Angiogenic peptide)-30は緑膿菌・黄色ブドウ球菌などに対する広い抗菌活性を有すると同時に強力な血管新生作用も有するユニークなペプチドである。この抗菌作用と血管新生作用の両方の特性を活かしながら外用薬として製剤化し、創傷治療薬、特に難治性皮膚潰瘍に対する創薬開発に向けた応用研究を行っている。初年度は、AG-30をリード化合物とした治療用ペプチドの最適化検討として、In silicoでの活性予測(Boman Index)および構造予測(AGADIR)などを用いながら、AG-30のアミノ酸を一部置換あるいは両端に構造を安定化する修飾（capping構造）を付与してペプチドの最適化を行なった結果、cationic なアミノ酸を多く付与することによって血管新生活性および抗菌活性がそれぞれ約4倍程度の活性増加を示す改変型AG-30(AE289)の作成に成功した。このペプチドは安定性試験(HPLCおよび抗菌活性試験)において、常温で1週間、冷蔵保存で1ヶ月以上の安定性を示した。一方、合成系の検討においても、将来的な大量合成に向けて液相法での合成方法を検討し、保護基の選定・脱保護方法・精製方法の検討を行ない、1gの大量合成に成功した。薬効評価として、マウス尾を用いた創傷モデルでAE289の濃度依存性な血流増加を認め、糖尿病モデルマウスでの創傷治癒評価系を確立し、AE289を連日投与したところ、創傷治癒の加速化が認められた。

平成20年度（単年度）の研究の要旨
引き続き新規ペプチドAG(Angiogenic peptide)-30の抗菌作用と血管新生作用の両方の特性を活かしながら外用薬として製剤化し、創傷治療薬、特に難治性皮膚潰瘍に対する創薬開発に向けた応用研究を行っている。初年度に作成したAE289のin silicoでの構造予測(AGADIR)とCDによる構造解析を行った。構造予測では、hydrophobicなアミノ酸を多く配することでヘリックス構造が安定し、逆にcationicなアミノ酸を多く配することで構造の安定性は低下すると予想されたが、CDでの解析ではどの改変型ペプチドもトリフロロエタノール(TFE)存在下でアルファヘリックス構造を呈していた。しかし、活性が最も高いAE289ではヘリックスのスコアは低下していたことから、cationicなアミノ酸によってヘリックス構造を若干とりにくくなった可能性が考えられる。液相法で作成したAE289に対して、従来の固相法で作成されたAE289との同等性試験を行い、同等の活性・抗菌性を有することを確認した。また、安定性試験としてヒト血清でのペプチドの安定性を検討したところ、これまでの抗菌ペプチドと同様に数時間で分解されることが分かった。薬効評価として、db/db糖尿病マウス皮膚損傷モデルにAE289を塗布した結果、対照群と比して創修復の加速化が確認された。また、薬効評価試験に向けてブタ皮膚創傷モデルでの治療評価系を確立した。

研究分担体制
（1）治療ペプチドの最適・合成・製剤化に関する研究
（分担研究代表者　中神啓徳　大阪大学大学院医学系研究科助教）
（担当研究者　金田安史・西川智之・二村圭祐　大阪大学大学院医学系研究科）
（2）治療ペプチドの薬効・安全性に関する研究
（分担研究代表者　金田安史　大阪大学大学院医学系研究科教授）
（担当研究者　玉井克人・片山一朗・吉良正浩　大阪大学大学院医学系研究科）
（3）臨床研究に関する研究
（統括研究代表者　玉井克人　大阪大学大学院医学系研究科准教授）
（担当研究者　片山一朗・吉良正浩・中神啓徳・西川智之　大阪大学医学系研究科）